Потолок
Рентгеноструктурный анализ кристаллов. Рентгеноструктурный анализ - это что такое? Методы рентгеновской съёмки кристаллов

Рентгеноструктурный анализ кристаллов. Рентгеноструктурный анализ - это что такое? Методы рентгеновской съёмки кристаллов

В настоящее время рентгенофазовый анализ (рентгенография, или дифракция рентгеновских лучей) является самым распространенным из дифракционных методов анализа. Следует отметить, что дифракционные методы применяются для изучения структуры не только твердых кристаллических веществ, но и жидкостей, и стекол. Жидкости и стекла, в которых существует определенная флуктирующая статистическая упорядоченность структурных элементов, также характеризуются неравномерностью рассеивания. При этом количество и резкость максимумов возрастает по мере перехода вещества в кристаллическое состояние.

Рентгенография основана на получении и анализе дифракционной картины, возникающей в результате интерференции рентгеновских лучей, рассеянных электронами атомов облучаемого объекта.

Явление интерференции рентгеновских лучей, рассеяных кристаллом, приводит к таким же результатам, какие дает зеркальное отражение лучей от атомных плокостей кристалла рис. 4.5.

Рис. 4.5. Отражение рентгеновских лучей

от атомных плоскостей кристалла:

q − угол скольжения (брегговский угол);

a − угол падения; d 1 , d 2 − межплоскостные расстояния

Отраженные лучи распространяются в единой фазе (интенсивность возрастает), если соблюдается уравнение Вульфа − Брегга:

n ∙ l = 2d sinq,

где n − порядок отражения; l − длина волны рентеновского луча; d − расстояние между атомными плоскостями кристалла; q − угол скольжения пучка лучей.

При изменении угла скольжения, когда уравнение Вульфа − Брегга не соблюдается, отраженные лучи распространяются в разных фазах и гасят друг друга.

Очевидно, что максимумы интенсивности отраженных лучей будут наблюдаться при различных значениях угла q для семейства плоских сеток с разными значениями d . Каждое кристаллическое вещество имеет индивидуальный набор семейств плоских сеток, следствием чего является индивидуальность дифракционной картины, т. е. распределение интенсивностей отражения в зависимости от значения угла q. Поэтому запись дифрактограммы и ведется в координатах I − q (интенсивность отраженных лучей − угол скольжения).

Для получения пучка рентгеновских лучей используют рентгеновские трубки (рис. 4.6), в которых рентгеновские лучи возникают в результате торможения электронов на металлическом аноде. Поток электронов, испускаемых вольфрамовой нитью и ускоренных в поле напряжения 30 кВ, бомбардирует металлическую мишень − анод рентгеновской трубки (из меди, кобальта или железа). Энергия первичных электронов достаточна для выбивания 1−S электрона (K − оболочка меди, рис. 4.7).

Рис. 4.6. Схема рентгеновской трубки:

1 − анод; 2 − вольфрамовая нить; 3 − окно

из Ni фольги; 4 − рентгеновский луч

Рис. 4.7. Возникновение CuK a −излучения

Электроны с внешних орбиталей немедленно переходят на освободившееся место, т. е. на внутренний 1s-уровень. Выделяющаяся при этом энергия испускается в виде рентгеновского излучения. Энергия такого перехода − строго фиксированная величина.

Для меди возможны два типа переходов: 2р ® 1s (K a -излучение; l = 1,5418 Å) и 3р ® 1s (K b -излучение; l = 1,3922 Å). Переходы первого типа происходят гораздо чаще, поэтому K a -излучение, более интенсивное. Для первичного рентгеновского луча желательно отфильтровать лучи с другими длинами волн, оставив лишь K a -излучение. Для этих целей применяется Ni-фольга, задерживающая K b -излучение.

У железного анода K a -излучение соответствует длине волны 0,1936 нм.

Существует три классических метода получения дифракционного эффекта от кристалла:

1) полихроматический метод (метод Лауэ), основанный на использовании сплошного спектра рентгеновкого излучения;

2) метод вращающегося монокристалла, основанный на использовании монохроматического излучения;

3) метод порошка (метод Дебая − Шеррера), в котором условия дифракции монохроматического рентгеновского излучения обусловлены большим числом различно ориентированных систем плоскостей.

Следует отметить, что в методах 1 и 2 необходимо использовать монокристаллический образец исследуемого вещества. Поскольку в реальности наиболее часто получаются вещества, обладающие поликристаллическим строением, то особенно важным с практической точки зрения становится метод 3.

Для регистрации дифракционной картины и угла дифракции в методе порошков используют несколько типов съемки, в настоящее время наиболее часто используются дифрактометры марки «ДРОН», общая схема которого представлена на рис. 4.8.

Рис. 4.8. Схема дифрактометра:

1 − рентгеновская трубка; 2 − диафрагма;

3 − образец; 4 − гониометр; 5 − счетчик;

6 − окружность движения счетчика

Образец находится в центре окружности постоянного радиуса, по которой движется счетчик. При этом образец вращается одновременно со счетчиком. Угловая скорость вращения счетчика в два раза превышает угловую скорость вращения образца. Таким образом, если образец поворачивается на некоторый угол q, то угол поворота счетчика составляет 2q. Рентгеновское излучение, отразившись от образца, попадает в счетчик, где преобразуется в электрический сигнал (в счетчике Гейгера − Мюллера используется способность рентгеновских лучей ионизировать газ). Записывается рентгенограмма в координатах I − 2q. В качестве примера ниже приведены рентгенограмма низкотемпературного кварца (рис. 4.9).

Рис. 4.9. Рентгенограмма низкотемпературного кварца

По характеру решаемых задач различают два вида рентгенографичского анализа:

− рентгеноструктурный анализ (РСА), предназначенный для определения параметров и качественных характеристик кристаллической решетки анализируемого вещества;

− рентгенофазовый анализ (РФА), состоящий в определении существования фаз (качественный анализ) и их относительного содержания в анализируемом образце (количественный анализ).

Рентгеноструктурный анализ. При исследовании структуры кристаллического вещества возникают следующие задачи:

− определение размера и формы элементарной ячейки кристаллической решетки, а следовательно, и количества атомов, приходящихся на каждую ячейку;

− определение конкретного положения (координаты) каждого симметрически независимого атома ячейки;

− определение констант тепловых колебаний атомов и распределения электронной плотности по атомам и между ними.

Рентгеноструктурный анализ является одним из наиболее информативных методов изучения кристаллических веществ.

Рентгенофазовый анализ. Большинство материалов состоит из нескольких фаз. Расшифровка качественного фазового состава и количественного соотношения разных фаз, определение типа и состояния твердых растворов, их возможной предельной концентрации являются наиболее распространенными материаловедческими задачами рентгенофазового анализа.

В общем рентгенофазовый анализ основан на двух положениях:

− каждая фаза дает присущий только ей (независимо от присутствия других фаз) набор дифракционных линий;

− интенсивность линий пропорцианальна содержанию фазы.

Характеристикой анализа является его чувствительность − минимальное количество вещества, при котором еще заметна самая сильная (реперная) линия. В основном чувствительность РФА не превышает нескольких процентов, так, например, для клинкерных минералов она составляет 2−3%.

Рентгенограмма многофазной системы представляет собой результат наложения рентгенограмм отдельных фаз. В случае, если содержание фазы невелико, то она будет представлена лишь ограниченным числом наиболее интенсивных линий.

Расшифровка рентгенограмм заключается в определении значений межплоскостных расстояний d по дифракционным максимумам и сравнительной интенсивности последних I .

Для расчетов значений межплоскостных расстояний устанавливается точное значение углов (2q) для дифракционных пиков (по их максимуму) и по соответствующим таблицам определяется значение межплоскостного расстояния d . Затем сопоставляется соответвтие набора рефлексов, близких по значениям d и I эталонным. Достоверность идентификации кристаллической фазы тем выше, чем больше отвечающих ей рефлексов на рентгенограмме. Обычно можно с уверенностью сказать о присутствии той или иной фазы при наличии не менее трех соответствующих ей рефлексов.

Поиск и идентификацию фаз проводят при помощи картотеки ASTM − ICPDS с использованием порошкового дифракционного файла PDF. В настоящее время для рентгенофазового анализа широко используется также компьютерная база данных ICDD.

Рентгеновский количественный фазовый анализ основан на сравнении интенсивности линий определяемых фаз между собой или с интенсивностью линии эталонного образца, полученной на рентгенограмме методом подмешивания эталона или методом назависимого эталона.

При этом в случае количественного анализа необходимы как можно более точные измерения интенсивности линий, особенно для фазы, количество которой невелико.

Брест, 2010

В рентгеноструктурном анализе в основном используются три метода

1. Метод Лауэ. В этом методе пучок излучения с непрерывным спектром падает на неподвижный монокристалл. Дифракционная картина регистрируется на неподвижную фотопленку.

2. Метод вращения монокристалла. Пучок монохроматического излучения падает на кристалл, вращающийся (или колеблющийся) вокруг некоторого кристаллографического направления. Дифракционная картина регистрируется на неподвижную фотопленку. В ряде случаев фотопленка движется синхронно с вращением кристалла; такая разновидность метода вращения носит название метода развертки слоевой линии.

3. Метод порошков или поликристаллов (метод Дебая-Шеррера-Хэлла). В этом методе используется монохроматический пучок лучей. Образец состоит из кристаллического порошка или представляет собой поликристаллический агрегат.

Метод Лауэ

Метод Лауэ применяется на первом этапе изучения атомной структуры кристаллов. С его помощью определяют сингонию кристалла и лауэвский класс (кристаллический класс Фриделя с точностью до центра инверсии). По закону Фриделя никогда невозможно обнаружить отсутствие центра симметрии на лауэграмме и поэтому добавление центра симметрии к 32-м кристаллическим классам уменьшает их количество до 11. Метод Лауэ применяется главным образом для исследования монокристаллов или крупнокристаллических образцов. В методе Лауэ неподвижный монокристалл освещается параллельным пучком лучей со сплошным спектром. Образцом может служить как изолированный кристалл, так и достаточно крупное зерно в поликристаллическом агрегате.

Формирование дифракционной картины происходит при рассеянии излучения с длинами волн от l min = l 0 = 12,4/U , где U- напряжение на рентгеновской трубке, до l m - длины волны, дающей интенсивность рефлекса (дифракционного максимума), превышающую фон хоть бы на 5 %. l m зависит не только от интенсивности первичного пучка (атомного номера анода, напряжения и тока через трубку), но и от поглощения рентгеновских лучей в образце и кассете с пленкой. Спектру l min - l m соответствует набор сфер Эвальда с радиусами от 1/ l m до 1/l min , которые касаются узла 000 и ОР исследуемого кристалла (рис.1).

Тогда для всех узлов ОР, лежащих между этими сферами, будет выполняться условие Лауэ (для какой-то определенной длины волны в интервале (l m ¸ l min)) и, следовательно, возникает дифракционный максимум - рефлекс на пленке. Для съемки по методу Лауэ применяется камера РКСО (рис.2).

Рис. 2 Камера РКСО

Здесь пучок первичных рентгеновских лучей вырезается диафрагмой 1 с двумя отверстиями диаметрами 0,5 - 1,0 мм. Размер отверстий диафрагмы подбирается таким образом, чтобы сечение первичного пучка было больше поперечного сечения исследуемого кристалла. Кристалл 2 устанавливается на гониометрической головке 3, состоящей из системы двух взаимно перпендикулярных дуг. Держатель кристалла на этой головке может перемещаться относительно этих дуг, а сама гониометрическая головка может быть повернута на любой угол вокруг оси, перпендикулярной к первичному пучку. Гониометрическая головка позволяет менять ориентацию кристалла по отношению к первичному пучку и устанавливать определенное кристаллографическое направление кристалла вдоль этого пучка. Дифракционная картина регистрируется на фотопленку 4, помещенную в кассету, плоскость которой расположена перпендикулярно к первичному пучку. На кассете перед фотопленкой натянута тонкая проволока, расположенная параллельно оси гониометрической головки. Тень от этой проволоки дает возможность определить ориентацию фотопленки по отношению к оси гониометрической головки. Если образец 2 располагается перед пленкой 4, то рентгенограммы, полученные таким образом называются лауэграммами. Дифракционная картина, регистрируемая на фотопленку, расположенную перед кристаллом, называется эпиграммой. На лауэграммах дифракционные пятна располагаются по зональным кривым (эллипсам, параболам, гиперболам, прямым). Эти кривые являются сечениями дифракционных конусов плоскостью и касаются первичного пятна. На эпиграммах дифракционные пятна располагаются по гиперболам, не проходящим через первичный луч.

Для рассмотрения особенностей дифракционной картины в методе Лауэ пользуются геометрической интерпретацией с помощью обратной решетки. Лауэграммы и эпиграммы являются отображением обратной решетки кристалла. Построенная по лауэграмме гномоническая проекция позволяет судить о взаимном расположении в пространстве нормалей к отражающим плоскостям и получить представление о симметрии обратной решетки кристалла. По форме пятен лауэграммы судят о степени совершенства кристалла. Хороший кристалл дает на лауэграмме четкие пятна. Симметрию кристаллов по лауэграмме определяют по взаимному расположению пятен (симметричному расположению атомных плоскостей должно отвечать симметричное расположение отраженных лучей). (См. рис. 3)

Рис. 3 Схема съемки рентгенограмм по методу Лауэ (а – на просвет, б – на отражение, F – фокус рентгеновской трубки, К – диафрагмы, O – образец, Пл - пленка)

Метод вращения монокристалла

Метод вращения является основным при определении атомной структуры кристаллов. Этим методом определяют размеры элементарной ячейки, число атомов или молекул, приходящихся на одну ячейку. По погасаниям отражений находят пространственную группу (с точностью до центра инверсии). Данные по измерению интенсивности дифракционных максимумов используют при вычислениях, связанных с определением атомной структуры. При съемке рентгенограмм методом вращения кристалл вращается или покачивается вокруг определенного кристаллографического направления при облучении его монохроматическим или характеристическим рентгеновским излучением. Первичный пучок вырезается диафрагмой (с двумя круглыми отверстиями) и попадает на кристалл. Кристалл устанавливается на гониометрической головке так, чтобы одно из его важных направлений (типа , , ) было ориентировано вдоль оси вращения гониометрической головки. Гониометрическая головка представляет собой систему двух взаимно перпендикулярных дуг, которая позволяет устанавливать кристалл под нужным углом по отношению к оси вращения и к первичному пучку рентгеновских лучей. Гониометрическая головка приводится в медленное вращение через систему шестерен с помощью мотора. Дифракционная картина регистрируется на фотопленке, расположенной по оси цилиндрической поверхности кассеты определенного диаметра (86,6 или 57,3 мм).

При отсутствии внешней огранки ориентация кристаллов производится методом Лауэ. Для этой цели в камере вращения предусмотрена возможность установки кассеты с плоской пленкой. Дифракционные максимумы на рентгенограмме вращения располагаются вдоль прямых, называемых слоевыми линиями. Максимумы на рентгенограмме располагаются симметрично относительно вертикальной линии, проходящей через первичное пятно. Часто на рентгенограммах вращения наблюдаются непрерывные полосы, проходящие через дифракционные максимумы. Появление этих полос обусловлено присутствием в излучении рентгеновской трубки непрерывного спектра наряду с характеристическим.

При вращении кристалла вокруг главного кристаллографического направления вращается связанная с ним обратная решетка. При пересечении узлами обратной решетки сферы распространения возникают дифракционные лучи, располагающиеся по образующим конусов, оси которых совпадают с осью вращения кристалла. Все узлы обратной решетки, пересекаемые сферой распространения при ее вращении, составляют эффективную, область, т.е. определяют область индексов дифракционных максимумов, возникающих от данного кристалла при его вращении. Для установления атомной структуры вещества необходимо индицирование рентгенограмм вращения. Индицирование обычно проводится графически с использованием представлений обратной решетки. Методом вращения определяют периоды решетки кристалла, которые вместе с определенными методом Лауэ углами позволяют найти объем элементарной ячейки. Используя данные о плотности, химическом составе и объеме элементарной ячейки, находят число атомов в элементарной ячейке.

Метод порошка

При обычном методе исследования поликристаллических материалов тонкий столбик из измельченного порошка или другого мелкозернистого материала освещается узким пучком рентгеновских лучей с определенной длиной волны. Картина дифракции лучей фиксируется на узкую полоску фотопленки, свернутую в виде цилиндра, по оси которого располагается исследуемый образец. Сравнительно реже применяется съемка на плоскую фотографическую пленку.

Принципиальная схема метода дана на рис. 4.

Рис. 4 Принципиальная схема съемки по методу порошка:

1 – диафрагма; 2 - место входа лучей;

3 - образец: 4 - место выхода лучей;

5 - корпус камеры; 6 - (фотопленка)

Когда пучок монохроматических лучей падает на образец, состоящий из множества мелких кристалликов с разнообразной ориентировкой, то в образце всегда найдется известное количество кристалликов, которые будут расположены таким образом, что некоторые группы плоскостей будут образовывать с падающим лучом угол q, удовлетворяющий условиям отражения.

1895 год оказался исключительно важным сперва для науки, а вскоре и для всего мира - именно тогда впервые открыли рентгеновские лучи, без которых сегодня нашу жизнь представить очень сложно. Слово страшное, все его боятся: это изучение, которое убивает! А после катастроф на АЭС и вовсе кровь в жилах стынет. Впрочем, про трагедии наслышаны все, а вот о пользе, которую это открытие дало людям, знают немногие. И речь идет не только лишь о специальных снимках - едва ли единственном эффективном методе выявления многих патологий. Еще одна область применения лучей - рентгеноструктурный анализ металлов, белков, иных соединений.

О чем идет речь

Рентгеновские лучи - электромагнитные колебания. Отличительная особенность - маленькая длина, сопоставимая с атомными габаритами. Источник излучения - быстрые электроны, влияющие на атомную структуру. В настоящее время излучение нашло себе применение в научно-техническом секторе.

Особенности лучей выявили в 1912 в ходе испытаний, проводимых немецкими учеными Книппингом, Фридрихом, Лауэ. При обследовании атомной решетки был установлен факт дифракции. Если сформировать узкий лучевой пучок и направить его на кристалл, обеспечив ему неподвижность, можно получить фракционную картинку на фотографической пластинке, размещенной позади кристалла. Отражение, полученное таким образом, представляло собой упорядоченную систему пятен, каждое из которых было следом определённого луча, рассеявшегося под влиянием кристалла. Изображение было решено назвать лауэграммой. Она легла в основу рентгеноструктурного анализа кристаллов, развивающегося и совершенствующегося в современности.

Тайны vs. наука

Применённый в биологии рентгеноструктурный анализ позволил проникнуть в тайную суть жизни. Впрочем, стоит отметить, что фундаментом для всего выступила квантовая физика - именно она дает обоснование явлениям, которые мы сейчас познаем с помощью рентгеновских лучей. Известно, что окружающее пространство, тела, предметы сформированы молекулами, атомами, сложенными в разные систематизированные, упорядоченные структуры. Выявление особенностей конкретного вещества может быть проведено только экспериментальным путем. В наши дни применение рентгеноструктурного анализа - эффективный, точный, современный способ определения атомного строения.

Для получения полезной информации необходимо использовать экспериментальные установки, где «работать» заставляют волны, чья длина - десять в минус десятой степени (!) метра. Именно таков масштаб расстояний на атомарном уровне. Для обывателя, далекого от физики, даже представить себе столь крошечные величины не представляется возможным - но ученые не просто смогли их разглядеть, но и проанализировали, заставили работать и производить еще больше информации, необходимой человечеству для познания окружающего мира и законов его построения.

Структуры и методики

Эксперименты 1912 года позволили сформулировать основные принципы рентгеноструктурного анализа, так как ученые получили эффективный метод выявления положения молекул, атомов внутри кристалла. Со временем также удалось собрать информацию о внутреннем строении молекул. Новые сведения быстро привлекли внимание самых светлых умов того времени, и за работу над еще только развивающимся рентгеноструктурным анализом взялись два британских ученых, отец и сын Брэгги. Именно они создали метод, благодаря которому человечество получило возможность очень точно определять молекулярную, минеральную структуру.

Со временем в фокусе внимания ученых оказывались все более сложные объекты, но рентгеноструктурный анализ показал себя на удивление универсальным. Постепенно очередь дошла до живых молекул. Сложно вообразить, насколько значим в настоящее время метод рентгеноструктурного анализа в биологии. Практически сразу ученые столкнулись со многочисленными сложностями, и в первую очередь - проблемой выделения кристаллов. Одна молекула - это несколько десятков тысяч атомов, что давало на снимке столь запутанное изображение, что восстановление координат не представлялось возможным. Но это только поначалу: годы шли, метод совершенствовался, в настоящее время эта задача уже решена.

Рентгеноструктурный анализ белков

Наиболее значимые исследования, связанные с этой тематикой, были организованы в Кавендишской лаборатории. Руководил ими уже упомянутый выше британец Брэгг. В качестве технического задания сформулировали задачу выявления белкового пространственного строения. Такая цель была закономерной: в середине прошлого столетия бытовало мнение, что самая важная для живого мира молекула - это белок. Для объяснения идеи аргументом был факт химических реакций, провоцируемых в клетке - ферментами, стимулирующими их, бывают только белки. Из этого ученые сделали закономерный вывод, что белок представляет собой основной строительный материал живой клетки, и освоение всех особенностей его структуры дало бы ответ на любые вопросы, связанные с фактом жизни. А изучить строение должен был помочь метод рентгеноструктурного анализа.

Итак, в центре внимания оказался сложный полимер - белок, звенья которого - мономеры, остатки аминокислот. Исследования показали, что таковые всегда линейны, а структура постоянна при повышении температур даже до того уровня, когда биологическая активность полностью угнетается. На основании полученных сведений стало ясно, что только остатки аминокислот в правильной последовательности еще не могут обеспечить возможность жизни, нужна также правильная компоновка групп в пространстве.

Успех не за горами

Примененный в лабораторных условиях рентгеноструктурный анализ помог решить поставленную перед учеными задачу. Успех пришел в середине пятидесятых, а первооткрывателями стали Перуц, Кендрю. Благодаря им в настоящее время мир знает, что белок имеет трехмерную структуру. Не менее важна и прочая информация, полученная разными учеными в ходе исследований и испытаний в попытке достичь поставленной цели. Многие данные, полученные в то время, в будущем помогли избежать ошибок и сделать более простым рентгеноструктурный анализ клетки.

В настоящее время посредством разработанной технологии можно изучить атом любого вещества и определить все специфические особенности элементарной ячейки, включая расположение в пространстве, форму, габариты. Рентгеноструктурный анализ позволяет выявить кристаллическую группу симметрии. В наши дни этот способ определения структуры вещества распространён шире любых других, что обусловлено его относительно низкой стоимостью, простотой реализации.

Рентгеновские спектры

Это понятие - одно из ключевых для теории рентгеноструктурного анализа. Принято говорить о двух типах: характеристическом, тормозном излучении. Тормозное обусловлено соответствующим движением электронов. Спровоцировать в лабораторных условиях это явление можно, если активировать антикатод установки. Ученый получает доступ к ограниченному широкому спектру. Каким образом будет расположена граница, от вещества не зависит, это полностью обусловлено энергетическими запасами направленных электронов. Тормозной спектр становится интенсивнее, если направленные частицы легче, а возбуждение электронов позволяет добиться очень высоких величин.

Используемое в методе рентгеноструктурного анализа характеристическое излучение сопровождается перемещением электронов. Расположенная на внутреннем атомном слое частица выбивается, с внешнего слоя заряженная частица переходит внутрь, весь процесс сопровождается определённой характеристикой - специфическим спектром, который во многом сходен с присущими газообразным веществам. Принципиальное отличие этих спектров - в зависимости (или ее отсутствии в случае рентгеновского изучения) от элемента, провоцирующего образование явления.

Рентген, результат и объект

Как показали испытания, проведенные с использованием различных соединений, рентгеноструктурный анализ в некоторой степени определяется его особенностью, отраженной через порядковый номер менделеевской таблицы: чем это значение больше, тем сильнее смещение к коротковолновому спектру. В 1913 было доказано: извлеченный из значения частоты квадратный корень линейно привязан к атомарному номеру. В будущем эта закономерность использовалась для обоснования менделеевской таблицы.

Следует учитывать, что разные элементы обладают разным спектром. При этом не наблюдается зависимости от возбуждаемости для испускания рентгеновского свечения в свободной форме, соединении с другими химическими элементами. На основании данных стало возможным проводить рентгеноструктурный анализ применительно к сложноструктурированных объектам. Выявленные спецификации стали базовыми для определения специфичности аналитического метода, сегодня обширно применяются.

Рентгеноструктурный анализ: теория и практика

В настоящее время эту методику анализа классифицируют как химический раздел, применимый для анализа вещественного состава. Интенсивность излучения определяется числом атомов, задействованных в процессе. Возбуждение провоцируется электронной бомбардировкой, облучением. В первом случае говорят о прямом возбуждении, при воздействии рентгеновских лучей - флуоресцентном (вторичном). Квант первичной радиации должен иметь энергетические запасы, превышающие расходы на выбивание электрона с занимаемой им позиции. Бомбардировка становится причиной специфического спектра и излучения - непрерывного, с высокой интенсивностью. Если предполагается вторичное возбуждение, тогда результат содержит линейчатый спектр.

Первичная возбуждаемость сопровождается нагревом субстанции. Флуоресцентное не провоцирует такого эффекта. При первичном методе веществом наполняют трубку, где создается высокий вакуум, а для флуоресцентной методологии необходимо расположить объект на пути рентгеновского излучения. Условие вакуума здесь не играет роли. Это довольно удобно: исследовав один объект, можно убрать образец и поместить следующий, процедура простая и практически не требует времени. В то же время вторичное излучение по интенсивности в тысячи раз слабее в сравнении с первичным методом. Тем не менее метод рентгеноструктурного анализа клетки обычно производится с применением именно вторичного, флуоресцентного излучения, предполагающего наличие быстрых электронов.

Что используется?

Для проведения анализа необходимо иметь в своем распоряжении специальный прибор. Полнопрофильный рентгеноструктурный анализ реализуется при помощи дифрактометра. Существует также флуоресцентный спектрометр. Этот прибор сформирован тремя ключевыми узлами: трубкой, анализатором, детектором. Первая является источником излучения, влияющего на флуоресцентный спектр исследуемого материала. Анализатор необходим, чтобы получить спектр. Детектор передает информацию об интенсивности, следующий шаг - фиксация результатов эксперимента.

На практике довольно часто используется такой спектрометр: излучающий источник, детектор расположены на специализированной окружности, центральное место принадлежит способному вращаться вокруг собственной оси кристаллу. Фактически ось пронизывает центр окружности.

Фокусирующий спектрометр

Как можно заключить из доступной для широкого круга лиц информации, в настоящее время методы, программы полнопрофильного рентгеноструктурного анализа труднодоступны, поэтому реальное широкое применение на практике не получили. Отмечается, что гораздо более актуальный вариант - это метод отражения, изобретённый Иоганном, Иогансоном и Капицей. Предполагается применение специализированного спектрометра. Альтернативный вариант - технология, авторами которой выступаю Коуш, Дю-Монд. Этот вариант именуется «на прохождение».

Указанные широко используемые в настоящее время методики бывают с одним либо многочисленными каналами. Многоканальные квантометры, аутрометры - это эффективный метод выявления многочисленных элементов. Сама работа, связанная с анализом, при применении такой технологии автоматизируется до высокого уровня. Преимущественно приборы оснащены трубками, устройствами, благодаря которым становится достижима повышенная стабилизационная степень интенсивности изучения. Спектрометр использует волны из диапазона, определённого анализатором. Для его плоскостей характерно некоторое конкретное расстояние, и невозможно отражение таких лучей, длина которых вдвое или больше, нежели межплоскостное анализатора.

Особенности реализации

В настоящее время используются самые разные элементы в качестве кристаллов. Наибольшее распространение получили слюда, гипс, кварц. Детекторами выступают гейгеровские счетчики, а также специализированные кристаллические, пропорциональные. В последнее время все активнее используются так называемые квантовые сцинтилляционные счётчики.

Из объектов, которые исследуются разными приборами, довольно часто внимание научных сотрудников привлекают ферриты висмута. Полнопрофильный рентгеноструктурный анализ BiFeO3 уже не раз становился главной темой научных работ в области химии, предполагается, что некоторые аспекты еще только предстоит открыть.

Область применения

Рентгеноспектральный анализ позволяет определять, как много в некотором соединении содержится целевого элемента, вызывающего интерес исследователя. Допускается исследовать сложные составы, сплавы, металлы. Нередко таким образом анализируют керамические, цементные соединения, пластмассовые. Можно исследовать даже пыль либо абразивные компоненты. Химтехнологии дают доступ к широкому спектру разнообразных продуктов, изучить особенности которых можно, прибегнув к рентгеновскому излучению. Самые актуальные области применения анализа - геология, металлургия, где аппаратура используется с целью выявления микроскопических, макроскопических компонентов.

Нет предела совершенству

Не всегда стандартная установка для рентгеноспектрального анализа позволяет получить необходимые сведения относительно исследуемого объекта. Для увеличения показателей чувствительности применимой методики допускается комбинирование нескольких вариантов подходов: радиометрия прекрасно сочетается с химическими способами. Наибольшая чувствительность определяется атомным номером вещества, которое предстоит выявить, а также средним номером образца. Если речь идет о легких элементах, задача считается довольно простой. Точность - 2-5 % (относительных), вес - считанные грамы, длительность - до двух часов, но иногда необходимо всего лишь несколько минут. А вот сложной считается задача, если речь идет о мягком спектре, небольшом Z.

Анализ белков: особенности

Одно из очень важных направлений использования описываемой методики - анализ белков. Как выше было указано, для получения точной информации об исследуемом объекте его необходимо изучать в виде кристалла, но в нормальном состоянии белковая молекула не имеет такой формы. Для проведения анализа необходимо преобразование.

Как это происходит?

Почти любое исследование белка в рамках эксперимента предполагает биохимическую методику добычи исходного вещества. Биологический материал измельчают, переводят белок в растворенное состояние и из общей смеси выделяют необходимый объект, который и будут дальше исследовать. Во многом результативность мероприятия зависит от качества выделения белка.

Чтобы можно был прибегнуть к анализу с использованием рентгеновского излучения, необходимо сформировать кристаллы. Если соединение сложное, рабочий процесс затягивается надолго. Как правило, в качестве исходного состава применяют насыщенный раствор, который затем обрабатывают, и жидкость испаряется. Второй вариант предполагает температурное влияние. Получаемые в итоге компоненты можно исследовать в специальной установке.

В природе встречается примерно 10 12 различных белков, выполняющих самые разнообразные функции. Это и белки-ферменты, катализирующие биохимические процессы в живой клетке; и белки-переносчики, позволяющие другим молекулам проходить через ядерные или клеточные мембраны или перемещаться между клетками всего организма; и иммуноглобулярные белки, отличающиеся высокой специфичностью взаимодействия с антигенами, что приводит к активации сигнальных путей, обеспечивающих иммунный ответ клеток. Это лишь несколько примеров уникальных свойств белковых молекул. По образному выражению Фрэнсиса Крика, белки важны прежде всего потому, что они могут выполнять самые разнообразные функции, причем с необыкновенной легкостью и изяществом.

При всем своем структурном и функциональном многообразии все природные белки построены из 20 аминокислот, соединенных в соответствии с кодом белкового синтеза. В зависимости от последовательности аминокислотных остатков в полипептидной цепи формируется определенная стабильная трехмерная структура белка, определяющая его структурные и функциональные свойства. Например, для каждого фермента характерна вполне определенная конформация активного центра, обеспечивающего специфическое взаимодействие с молекулами субстратов и осуществляющего каталитический акт. Причем для эффективного образования фермент-субстратного комплекса большое значение имеет не только геометрическое соответствие (комплементарность) молекул фермента и субстрата, но и образование водородных связей, электростатические и гидрофобные взаимодействия между атомами активного центра фермента и молекулы субстрата. Таким образом, любая белковая молекула характеризуется уникальностью структуры, которая определяет уникальность ее функции.

Выяснение пространственной организации белков – одно из основных направлений современной биохимии. Во многих случаях знание структуры белка и его комплекса с ингибиторами является решающим фактором при создании лекарственных препаратов.

Одним из важнейших экспериментальных методов, позволяющих с атомарной точностью узнать, что представляет собой трехмерная структура белка, т.е. определить пространственные координаты всех атомов исследуемого объекта, является рентгеноструктурный, или кристаллографический, анализ. Зная положение каждого атома, можно вычислить межатомные расстояния, валентные углы, углы вращения вокруг связей, распределение поверхностного заряда и другие детали молекулярной геометрии. Эти данные нужны химикам, биохимикам и биологам, изучающим зависимости между структурными характеристиками и функциональными свойствами, а также специалистам, занимающимся изучением электронной структуры молекул и молекулярных взаимодействий. Особое место рентгеноструктурного анализа среди других экспериментальных методов отражает тот факт, что с момента открытия рентгеновских лучей в 1901 г. по настоящее время работы в этой области 12 раз отмечались Нобелевскими премиями.

Применение рентгеноструктурного анализа для исследования сложноорганизованных биологических объектов началось после 1953 г., когда сотрудник Кавендишской лаборатории Кембриджского университета Макс Перутц нашел способ определения структуры крупных молекул, таких как миоглобин и гемоглобин. С тех пор рентгеноструктурный анализ молекул белка помогает нам понять химию биологических реакций. На сегодняшний день известны структуры около 15 тыс. белков и их комплексов с биологически важными молекулами.

Рентгеновские лучи являются электромагнитными волнами с длинами в диапазоне 0,01–10 нм. С коротковолновой стороны они соседствуют с -лучами (длины волн менее 0,1 нм), с длинноволновой – с ультрафиолетовыми (длины волн примерно 10–380 нм).

Для проведения рентгеновского эксперимента необходимо монохроматическое рентгеновское излучение (т.е. строго определенной длины волны). Для этой цели используются различные фильтры и монохроматоры.

Обычно, когда человек слышит о рентгеновском исследовании, он вспоминает рентгеновский кабинет в поликлинике. На самом деле рентгеноструктурный анализ не имеет ничего общего с медицинскими исследованиями. Медицинская рентгеноскопия основана на различии в степени поглощения рентгеновских лучей разными тканями, а рентгеновская кристаллография – на рассеянии рентгеновских лучей электронами атомов. Если в медицине мы получаем рентгеновский снимок исследуемого объекта, то в рентгеновской кристаллографии снимки не содержат никакого изображения чего бы то ни было.

Как же ставится рентгеновский эксперимент? Принципиальная схема проста (рис. 1): исследуемый объект помещают в пучок рентгеновских лучей и измеряют интенсивность рассеянного в различных направлениях излучения. Самый простой способ – поместить на пути пучка лучей фотопленку и по степени потемнения пятна после проявления судить об интенсивности рассеяния в этом направлении. Конечно, на сегодняшний день существуют и более совершенные методы, но сейчас это не важно. В данном случае важно то, что мы смотрим не на интенсивность лучей, прошедших сквозь объект, а на интенсивность лучей, возникших там, где их вроде бы и не должно было быть.

Рис. 1. Схема рентгеновского эксперимента

Итак, на входе мы имеем неизвестный объект, на выходе – набор интенсивностей рассеянных в различных направлениях лучей, или дифракционную картину. Теперь необходимо связать полученную в эксперименте информацию с атомной структурой исследуемого объекта. Перечислим основные положения, на которых строится простейшая математическая модель рассеяния рентгеновских лучей:

1) пучок рентгеновских лучей является плоской монохроматической электромагнитной волной;
2) под воздействием этой электромагнитной волны каждый электрон приходит в движение, которое может быть описано уравнениями для свободных зарядов;
3) движущийся электрон является, в свою очередь, источником новой рассеянной сферической электромагнитной волны, распространяющейся во всех направлениях;
4) эти новые волны суммируются и определяют интенсивность излучения в интересующем нас направлении.

Такая модель называется кинематической теорией рассеяния . Ее основной недочет заключается в том, что на электрон действует не только первичный пучок, но и рассеянные волны, и их влияние может изменять характер его движения. Попытка учесть эти поправки делается в более изощренной динамической теории рассеяния, однако для практических приложений более простая кинематическая теория рассеяния оказывается, как правило, вполне достаточной.

Метод рентгеноструктурного анализа основан на дифракции рентгеновских лучей на кристаллической решетке и поэтому применим только к веществам в кристаллическом состоянии. Это связано с тем, что для регистрации дифракционной картины рассеяния необходимо иметь достаточное количество рассеивающих электронов. Но если образец состоит из большого числа произвольно ориентированных идентичных молекул (раствор), то картина рассеяния будет определяться какими-то усредненными по всевозможным ориентациям характеристиками и вряд ли позволит получить детальную информацию об атомной структуре. Другое дело, если большое количество одинаковых молекул ориентированы одинаково. Такую возможность дают нам кристаллические образцы.

Говоря простыми словами (и не вдаваясь в сложные математические формулировки), кристалл – это такой образец исследуемого вещества, в котором много (~10 12) идентичных молекул находятся в одинаковой ориентации и их центры образуют правильную трехмерную решетку.

Основная особенность структуры каждого кристалла состоит в том, что он построен из регулярно расположенных в пространстве отдельных атомов или групп атомов. Если каждую повторяющуюся структурную единицу заменить точкой, или узлом, то получится трехмерная кристаллическая решетка (рис. 2). Решетку можно представить себе как систему одинаковых параллелепипедов. Каждый такой параллелепипед носит название «элементарная ячейка кристалла» и описывается шестью параметрами: длинами ребер (a, b, c) и углами между ними (, , ).

Одна из основных претензий к методу рентгеноструктурного анализа с самого начала исследования структур белков – это то, что в жизни белки находятся в растворе, а при исследовании мы их кристаллизуем. Возникает логичный вопрос: не происходит ли принципиальных искажений структуры молекул белка при кристаллизации? Принято считать, что сильных искажений все-таки не происходит. Доводы в пользу такой позиции следующие.

Во-первых, ряд белков сохраняют ферментативную активность и в закристаллизованном состоянии, т.е. структура изменяется не настолько, чтобы белок стал «неработоспособен». Другое соображение: в кристаллах биомакромолекул значительный объем (от 30 до 80%) занимает растворитель, т.е. упаковка молекул белка в кристалле не плотная и вряд ли вызывает существенные искажения. Некоторые искажения в свободных петлях возможны, но структура активного центра сохраняется. Еще одно подтверждение: альтернативное определение структур некоторых белков методом двумерного ядерного магнитного резонанса не дало существенных расхождений со структурами, расшифрованными рентгеновскими методами.

Монохроматическое рентгеновское излучение, проходя через кристалл, рассеивается в основном на электронных оболочках периодически повторяющихся атомов и образует дифракционную картину, или рентгенограмму (рис. 3). Поэтому экспериментальные рентгеновские данные позволяют судить об особенностях расположения электронов в элементарных кристаллических ячейках. Электрон обладает волновыми свойствами, и его положение в пространстве характеризуется не точными координатами, а функцией распределения электронной плотности (r), которая дает среднее по времени число электронов, приходящееся на 1 3 (кубический ангстрем). На основании этой функции можно судить о расположении атомов в элементарных ячейках, т.к. каждому атому соответствует сгусток электронной плотности определенной величины. Таким образом, при обработке данных рентгеновского эксперимента нужно решить две задачи.

Рис. 3. В дифракционной картине заключена вся информация о структуре белка

1. Из данных рентгенограммы получить карту распределения электронной плотности (r) в кристалле исследуемого объекта. На этом этапе возникает принципиальная трудность (о которой речь пойдет ниже), связанная с невозможностью получить из эксперимента всю информацию, необходимую для восстановления исследуемой структуры. Для получения недостающей части информации используют различные обходные пути. Но универсального пути нет, и в каждом случае исследователь выбирает наиболее подходящий, основываясь на своем опыте и интуиции.

2. На основании карты распределения электронной плотности (r) определить положения атомов в исследуемом объекте. Для решения этой задачи структура многократно подвергается программной обработке и ручной доводке для достижения наилучшего совпадения с электронной плотностью.

Основные этапы определения структуры белка

Выделение, очистка

С этого этапа начинаются практически все экспериментальные исследования белковых структур. Для получения нужного белка используют различные биохимические методы. Последовательность операций по выделению белков обычно сводится к измельчению биологического материала (гомогенизация), извлечению из него белков, а точнее – переводу белков в растворенное состояние (экстракция) и выделению исследуемого белка из смеси других белков, т.е. очистке и получению индивидуального белка. На этом этапе наибольшая сложность заключается в наработке достаточного для эксперимента количества чистого белка.

Кристаллизация

Получение кристаллов, пригодных для рентгеноструктурного анализа, зачастую процесс трудоемкий и далеко не тривиальный, особенно для сложных соединений, таких как белки и нуклеиновые кислоты. Наличие пересыщенного раствора – необходимое условие кристаллизации. Для получения такого раствора используют различные способы. Один из них заключается в постепенном удалении растворителя обычным испарением, что приводит к росту концентрации вещества в растворе, который в какой-то момент становится пересыщенным. Другой способ связан с использованием зависимости растворимости от температуры. Например, если растворимость с увеличением температуры повышается, можно приготовить насыщенный раствор при более высокой температуре, а затем медленно охладить его. Благодаря понижению растворимости в процессе охлаждения получается пересыщенный раствор. Третий способ связан с введением в раствор какого-либо вещества, вызывающего понижение растворимости. В качестве таких веществ используют либо соли, либо органические растворители. Кроме того, растворимость белков и нуклеиновых кислот сильно зависит от pH раствора, это тоже можно использовать для получения пересыщенных растворов.

На практике все намного сложнее. До сих пор не существует универсальных способов подбора оптимальных условий кристаллизации. Для каждого конкретного белка исследователь ищет эти условия, меняя тип буфера, значения pH, температуры, концентрации самого белка, осаждающей соли и т.д. В этой работе важно найти такие условия, при которых получится именно кристалл, а не выпадет соль. Поэтому выращивание биологических кристаллов не только научное направление, но и искусство. Иногда, чтобы заставить белок кристаллизоваться, его центрифугируют или даже отправляют в невесомость.

Выбор кристаллов для рентгеновского эксперимента проводят с помощью микроскопа. Для этой цели особенно полезен поляризационный микроскоп, позволяющий с помощью поляризационного света установить наличие дефектов в кристалле. Оптимальными считаются монокристаллы с размером каждой из сторон 0,2–0,6 мм. Кристаллы должны быть без дефектов и, по возможности, с хорошей огранкой. Наличие дефектов приводит к ошибкам при экспериментальном измерении дифракционной картины и, как следствие, к неточности (а часто и к невозможности) расшифровки кристаллической структуры. При повышении сложности исследуемого объекта требования к качеству кристаллов повышаются. Как выглядят кристаллы белков, показано на рис. 4.

Рис. 4. Кристаллы белков: а – кристаллы зеленого флуоресцентного белка zGFP506; б – кристаллы мутанта белка zGFP506 с аминокислотной заменой N66D

К сожалению, далеко не всегда удается получить кристалл изучаемого белка, поэтому этот этап является главным ограничением метода рентгеноструктурного анализа белков.

Рентгеновский эксперимент, обработка результатов

В качестве источника рентгеновских лучей в настоящее время стараются использовать синхротронный ускоритель. Это довольно дорогое сооружение. Лабораторные рентгеновские установки тоже используются, но синхротронное излучение имеет существенные преимущества.

Во-первых, это мощность пучка. Здесь два плюса. Первый понятен – сокращается время эксперимента. Второй – биологические кристаллы имеют тенденцию разрушаться под действием рентгеновского излучения. Процесс разрушения занимает определенное время, и если пучок мощный, то можно успеть зарегистрировать нужную картину, пока кристалл не разрушился.

Во-вторых, это возможность получить желаемую длину волны. Рентгеновские трубки дают мощный пучок только фиксированной длины волны (обычно около 1,57), в то время как при проведении эксперимента зачастую необходимо иметь возможность выбора длины волны. Это позволяет сделать синхротрон.

Обработка результатов рентгеновского эксперимента базируется на мощном математическом аппарате, который здесь мы рассматривать не будем. Когда монохроматический рентгеновский луч падает на определенным образом ориентированный кристалл, то рассеяние происходит в дискретных направлениях, определяемых кристаллической решеткой. Дифракционная картина, возникающая на пленке детектора (рис. 3), представляет собой набор пятен, или рефлексов. Измерив интенсивность рефлексов, можно получить значения модулей т.н. структурных факторов (комплексных чисел), описывающих распределение электронной плотности в кристалле (r). Но чтобы однозначно определить (r), нужно знать еще и соответствующие значения фаз этих факторов, информация о которых не содержится в дифракционной картине. Если для какого-либо кристалла фазы определены, то расчет положений атомов этого кристалла не составляет принципиальных трудностей.

Таким образом, центральная проблема метода рентгеноструктурного анализа, называемая фазовой проблемой , заключается в невозможности получения всех необходимых для расчета данных непосредственно из эксперимента.

Общего решения фазовой проблемы на сегодня не существует. Каждый случай требует специального подхода. Здесь важно понимать, что новая информация не берется ниоткуда. Для того чтобы получить значения фаз, мы должны либо сделать какие-то новые предположения о структуре и особенностях объекта, либо провести новые эксперименты. Ниже приведены основные подходы к решению «фазовой проблемы», применяемые в белковой кристаллографии.

Изоморфное замещение

Можно попытаться внедрить в молекулы кристалла некую метку – один или несколько тяжелых атомов (например, ионы тяжелых металлов), которые могут быть либо добавлены к нативной структуре, либо могут замещать часть ее атомов (рис. 5).

Под изоморфным внедрением тяжелых атомов подразумевается, что они присоединяются к каждому экземпляру молекулы в одном и том же месте, и структура молекулы белка при этом не изменяется. Затем, проведя дополнительно рентгеновский эксперимент с таким модифицированным соединением и определив изменения интенсивностей рефлексов по сравнению с нативным белком, можно получить дополнительную информацию о значениях фаз. Трудность этого метода заключается в том, что не всегда удается получить хорошее изоморфное производное, а также в необходимости проведения дополнительного рентгеновского эксперимента.

Метод изоморфного замещения является основным методом решения фазовой проблемы при определении структуры биологических макромолекул. Сам этот метод возник достаточно давно, но именно при работе с белками он приобрел исключительно важную роль. Причин этому две:

1) долгое время он являлся единственным методом, позволяющим решать фазовую проблему для белков;

2) именно для белков удается «достаточно просто» получать изоморфные производные. Последнее связано с тем, что кристаллы белка довольно рыхлые – в них от 30 до 70% объема занято растворителем, т.е. в кристаллах есть «пустоты», куда могут поместиться дополнительные атомы.

Использование эффекта аномального рассеяния

Этот метод основан на варьировании длины волны падающего на кристалл рентгеновского излучения вблизи значений, при которых наблюдается эффект резонанса (и соответствующее аномальное рассеяние) для нескольких «специальных» атомов, содержащихся в структуре макромолекулы. Если аномально рассеивающих атомов в белке нет, иногда можно попытаться присоединить их химическим путем. Дифракционные картины получают для нескольких значений длины волны падающего луча и на основании анализа разностей интенсивностей соответствующих рефлексов оценивают значения фаз.

Успех метода аномального рассеяния, как и изоморфного замещения, во многом зависит от возможности экспериментального получения производных с требуемыми свойствами.

Упомянутые два способа отвечают попытке решить фазовую проблему за счет дополнительной информации, получаемой из дополнительных экспериментов. Следующий способ применяют в ситуации, когда нам известна структура близкого (гомологичного) белка.

Метод молекулярного замещения

В биологии распространена ситуация, когда существуют ряды объектов, похожих друг на друга, т.е. имеющих структурную гомологию. Такой гомологией могут обладать, например, белки одного типа, выделенные из разных организмов. В этом случае можно надеяться, что фазы структурных факторов, рассчитанные по известной атомной модели гомологичного белка, будут достаточно хорошим начальным приближением к значениям неизвестных фаз, отвечающих исследуемому объекту. Комбинируя их далее с измеренными в эксперименте модулями структурных факторов для исследуемого объекта, мы можем получить хорошее приближение к искомому распределению электронной плотности.

Однако для того чтобы надеяться на успех на этом пути, надо, как минимум, для начала «разместить» известный гомологичный объект на том же месте и в той же ориентации, что и исследуемый белок. Процедуру создания такого «компьютерного гибрида», в котором внутри элементарной ячейки кристалла одного белка размещается молекула другого, называют методом молекулярного замещения. Судить о том, насколько полученное размещение близко к действительности, можно, сравнивая рассчитанные по модели модули структурных факторов с величинами, полученными в эксперименте. Разумеется, такое замещение – всего лишь умозрительная процедура, и никакого химического замещения не происходит.

«Прямые» методы

В отличие от предыдущих подходов, эти методы опираются не на дополнительный эксперимент или информацию о структуре гомологичного объекта, а на почти философскую идею об атомности изучаемого объекта. Под «прямыми» методами в кристаллографии понимаются стратегии определения структур, использующие в качестве стартовой информации только набор интенсивностей рефлексов, полученный в рентгеновском эксперименте. Для определения фаз структурных факторов в них используют вероятностный подход. «Прямые» методы более объективны в том смысле, что они зависят только от применения математических соотношений.

На основе «прямых» методов определяют структуры большинства низкомолекулярных соединений. Эти методы не требуют ни дополнительных экспериментов, ни тонкой биохимической работы по получению изоморфных производных, ни наличия известных гомологичных структур, но к сожалению, пока не применимы к структурам белков из-за принципиальных ограничений на количество атомов исследуемой структуры.

Если известны и модуль, и фаза структурных факторов, то мы можем восстановить распределение (r), рассчитав обратное преобразование Фурье. Это не сложная с современной точки зрения вычислительная задача, и этот шаг выделяется потому, что он подводит итог важного этапа работ. Мы, наконец, получаем возможность «взглянуть» на интересующий нас объект. И по тому, насколько «четким» получилось изображение, – судить об успешности всех предыдущих этапов работы. А в случае неудачи – повторить все сначала.

Следующий этап заключается в построении приближенной атомной модели по рассчитанным картам распределения электронной плотности. Эта работа требует максимального использования интеллекта человека и осуществляется квалифицированными специалистами.

С помощью специальных компьютерных программ, исследователь вручную вписывает атомы белковой структуры в полученную на предыдущем этапе карту электронной плотности (рис. 6).

Рентгеновские лучи, открытые в 1895 г. В. Рентгеном – это электромагнитные колебания весьма малой длины волны, сравнимой с атомными размерами, возникающими при воздействии на вещество быстрыми электронами.

Рентгеновские лучи широко используются в науке и технике.

Их волновая природа установлена в 1912 г. немецкими физиками М.Лауэ, В.Фридрихом и П. Книппингом, открывшими явление дифракции рентгеновских лучей на атомной решётке кристаллов. Направив узкий пучок рентгеновских лучей на неподвижный кристалл, они зарегистрировали на помещённой за кристаллом фотопластинке дифракционную картину, которая состояла из большого числа закономерно расположенных пятен. Каждое пятно - след дифракционного луча, рассеянного кристаллом. Рентгенограмма, полученная таким методом носит название лауэграммы. Это открытие явилось основой рентгеноструктурного анализа.

Длины волн рентгеновских лучей, используемых в практических целях, лежат в пределах от нескольких ангстрем до долей ангстрема (Å), что соответствует энергии электронов, вызывающих рентгеновское излучение от 10³до10 5 эв.

Рентгеноструктурный анализ это метод исследования строения тел, использующий явление дифракции рентгеновских лучей, метод исследования структуры вещества по распределению в пространстве и интенсивностям рассеянного на анализируемом объекте рентгеновского излучения. Дифракционная картина зависит от длины волны используемых рентгеновских лучей и строения объекта. Для исследования атомной структуры применяют излучение с длиной волны ~1Å, т.е. порядка размеров атома.

Методами рентгеноструктурного анализа изучают металлы, сплавы, минералы, неорганические и органические соединения, полимеры, аморфные материалы, жидкости и газы, молекулы белков, нуклеиновых кислот и т.д. Рентгеноструктурный анализ является основным методом определения структуры кристаллов. При исследовании кристаллов он даёт наибольшую информацию. Это обусловлено тем, что кристаллы обладают строгой периодичностью строения и представляют собой созданною самой природой дифракционную решётку для рентгеновских лучей. Однако он доставляет ценные сведения и при исследовании тел с менее упорядоченной структурой, таких, как жидкости, аморфные тела, жидкие кристаллы, полимеры и другие. На основе многочисленных уже расшифрованных атомных структур может быть решена и обратная задача: по рентгенограмме поликристаллического вещества, например легированной стали, сплава, руды, лунного грунта, может быть установлен кристаллический состав этого вещества, то есть выполнен фазовый анализ.

В ходе рентгеноструктурного анализа исследуемый образец помещают на пути рентгеновских лучей и регистрируют дифракционную картину, возникающую в результате взаимодействия лучей с веществом. На следующем этапе исследования анализируют дифракционную картину и расчётным путём устанавливают взаимное расположение частиц в пространстве, вызвавшее появление данной картины.

Рентгеноструктурный анализ кристаллических веществ распадается на два этапа.

1) Определение размеров элементарной ячейки кристалла, числа частиц (атомов, молекул) в элементарной ячейке и симметрии расположения частиц (так называемой пространственной группы). Эти данные получают путём анализа геометрии расположения дифракционных максимумов.

2) Расчёт электронной плотности внутри элементарной ячейки и определение координат атомов, которые отождествляются с положением максимумов электронной плотности. Эти данные получают анализом интенсивности дифракционных максимумов.

Методы рентгеновской съёмки кристаллов.

Существуют различные экспериментальные методы получения и регистрации дифракционной картины. В любом случае имеется источник рентгеновского излучения, система для выделения узкого пучка рентгеновских лучей, устройство для закрепления и ориентирования образца в пучке и приёмник рассеянного образцом излучения. Приёмником служит фотоплёнка, либо ионизационные или сцинтилляционные счётчики рентгеновских квантов. Метод регистрации с помощью счётчиков (дифрактометрический) обеспечивает значительно более высокую точность определения интенсивности регистрируемого излучения.

Из условия Вульфа – Брэгга непосредственно следует, что при регистрации дифракционной картины один из двух входящих в него параметров ¾l -длина волны или q -угол падения, должен быть переменным.

Основными рентгеновской съёмки кристаллов являются: метод Лауэ, метод порошка (метод дебаеграмм), метод вращения и его разновидность – метод качания и различные методы рентгенгониометра.

В методе Лауэ на монокристаллический образец падает пучок немонохроматических («белых») лучей (рис.). Дифрагируют лишь те лучи, длины волн которых удовлетворяют условию Вульфа – Брэгга. Дифракционные пятна на лауграмме (рис.) располагаются по эллипсам, гиперболам и прямым, обязательно проходящим через пятно от первичного пучка.

Рис.– Схема метода рентгеновской съёмки по Лауэ: 1- пучок рентгеновских лучей, падающих на монокристаллический образец; 2 – коллиматор; 3 – образец; 4 – дифрагированные лучи; 5 – плоская фотоплёнка;

б – типичная лауэграмма.

Важное свойство лауэграммы состоит в том, что при соответствующей ориентировке кристалла симметрия расположения этих кривых отражает симметрию кристалла. По характеру пятен на лауэграммах можно выявить внутренние напряжения и некоторые другие дефекты кристаллической структуры. Индицирование же отдельных пятен лауэграммы весьма затруднительно. Поэтому метод Лауэ применяют исключительно для нахождения нужной ориентировки кристалла и определения его элементов симметрии. Этим методом проверяют качество моно кристаллов при выборе образца для более полного структурного исследования.

В методе порошка (рис),так же как и во всех остальных описываемых ниже методах рентгеновской съёмки, используется монохроматическое излучение. Переменным параметром является угол q падения так как в поликристаллическом порошковом образце всегда присутствуют кристаллики любой ориентации по отношению к направлению первичного пучка.

Рис– схема рентгеновской съёмки по методу порошка: 1 – первичный пучок; 2 – порошковый или поликристаллический образец; 3 – фотоплёнка, свёрнутая по окружности; 4 – дифракционные конусы; 5 – «дуги» на фотоплёнке, возникающие при пересечении её поверхности с дифракционными конусами;

б – типичная порошковая рентгенограмма (дибаеграмма).

Лучи от всех кристалликов, у которых плоскости с данным межплоскостным расстоянием d hk1 находятся в «отражающем положении», то есть удовлетворяют условию Вульфа – Брэгга, образуют вокруг первичного луча конус с углом растра 4q. Каждому d hk1 соответствует свой дифракционный конус. Пересечение каждого конуса дифрагированных рентгеновских лучей с полоской фотоплёнки, свёрнутой в виде цилиндра, ось которого проходит через образец, приводит к появлению на ней следов, имеющих вид дужек, расположенных симметрично относительно первичного пучка (рис.). Зная расстояния между симметричными «дугами», можно вычислить соответствующие им межплоскостные расстояния d в кристалле.

Метод порошка наиболее прост и удобен с точки зрения техники экспермента, однако единственная поставляемая им информация – выбор межплоскостных расстояний – позволяет расшифровывать самые простые структуры.

В методе вращения (рис.) переменным параметром является угол q.

Съёмка производится на цилиндрическую фотоплёнку. В течение всего времени экспозиции кристаллравномерно вращается вокруг свей оси, совпадающей с каким-либо важным кристаллографическим направлением и с осью образуемого планкой цилиндра. Дифракционные лучи идут по образующим конусов, которые при пересечении с плёнкой дают линии, состоящие из пятен (так называемые слоевые линии.

Метод вращения даёт экспериментатору более богатую информацию, чем метод порошка. По расстояниям между слоевыми линиями можно рассчитать период решётки в направлении оси вращения кристалла.

Рис. – схема рентгеновской съёмки по методу вращения: 1 – первичный пучок;

2 – образец (вращается по стрелке); 3 – фотоплёнка цилиндрической формы;

б – типичная рентгенограмма вращения.

В рассматриваемом методе упрощается индицирование пятен рентгенограммы. Так если кристалл вращается вокруг оси с решётки, то все пятна на линии, проходящей через след первичного луча, имеют индексы (h,k,0), на соседних с ней слоевых линиях – соответственно (h,k,1) и (h,k,1 ¯) и так далее. Однако и метод вращения не даёт всей возможной информации, так никогда неизвестно, при каком угле поворота кристалла вокруг оси вращения образовалось то или иное дифракционное пятно.

В методе качания , который является разновидностью метода вращения, образец не совершает полного вращения, а «качается» вокруг той же оси в небольшом угловом интервале. Это облегчает индицирование пятен, так как позволяет как бы получать рентгенограмму вращения по частям и определять с точностью до величины интервала качания, под каким углом поворота кристалла к первичному пучку возникли те или иные дифракционные пятна.

Наиболее богатую информацию дают методы рентгеногониометра . Рентгеновский гониометр, прибор, с помощью которого можно одновременно регистрировать направление дифрагированных на исследуемом образце рентгеновских лучей и положение образца в момент возникновения дифракции. Один из них – метод Вайссенберга, является дальнейшим развитием метода вращения. В отличие от последнего, в рентгеногониометре Вайссенберга все дифракционные конусы, кроме одного, закрываются цилиндрической ширмой, а пятна оставшегося дифракционного конуса (или, что то же, слоевой линии) «разворачиваются» на всю площадь фотоплёнки путём её возвратно-поступательного осевого перемещения синхронно с вращением кристалла. Это позволяет определить, при какой ориентации кристалла возникло каждое пятно вассенбергограммы.

Рис. Принципиальная схема рентгенгониометра Вайссенберга: 1 – неподвижная ширма, пропускающая только один дифракционный конус; 2 – кристалл, поворачивающийся вокруг оси Х – Х; 3 – цилиндрическая фотоплёнка, двигающаяся поступательно вдоль оси Х – Х синхронно с вращением кристалла 2; 4 – дифракционный конус, пропущенный ширмой; 5 – первичный пучок.

Существуют и другие методы съёмки, в которых применяется одновременное синхронное движение образца и фотоплёнки. Важнейшими из них являются метод фотографирования обратной решётки и прецессионный метод Бюргера. Во всех этих методах использована фотографическая регистрация дифракционной картины. В рентгеновском дифрактометре можно непосредственно измерять интенсивность дифракционных отражений с помощью пропорциональных, сцинтилляционных и других счётчиков рентгеновских квантов.

Применение рентгеноструктурного анализа.

Рентгеноструктурный анализ позволяет объективно устанавливать структуру кристаллических веществ, в том числе таких сложных, как витамины, антибиотики, координационные соединения и т.д. Полное структурное исследование кристалла часто позволяет решить и чисто химические задачи, например установление или уточнение химической формулы, типа связи, молекулярного веса при известной плотности или плотности при известном молекулярном весе, симметрии и конфигурации молекул и молекулярных ионов.

Рентгеноструктурный анализ с успехом применяется для изучения кристаллического состояния полимеров. Ценные сведения даёт рентгеноструктурный анализ и при исследовании аморфных и жидких тел. Рентгенограммы таких тел содержат несколько размытых дифракционных колец, интенсивность которых быстро падает с увеличением q. По ширине, форме и интенсивности этих колец можно делать заключения об особенностях ближнего порядка в той или иной конкретной жидкой или аморфной структуре.

Важной областью применения рентгеновских лучей является рентгенография металлов и сплавов, которая превратилась в отдельную отрасль науки. Понятие «рентгенография» включает в себя, наряду с полным или частичным рентгеноструктурным анализом, также и другие способы использования рентгеновских лучей – рентгеновскую дефектоскопию (просвечивание), рентгеноспектральный анализ, рентгеновскую микроскопию и другое. Определены структуры чистых металлов и многих сплавов. основанная на рентгеноструктурном анализе кристаллохимия сплавов – один из ведущих разделов металловедения. Ни одна диаграмма состояния металлических сплавов не может считаться надёжно установленной, если данные сплавы не исследованы методами рентгеноструктурного анализа. Благодаря применению методов рентгеноструктурного анализа оказалось возможным глубоко изучить структурные изменения, протекающие в металлах и сплавах при их пластической и термической обработке.

Метод рентгеноструктурного анализа свойственны и серьёзные ограничения. Для проведения полного рентгеноструктурного анализа необходимо, чтобы вещество хорошо кристаллизовалось и давало достаточно устойчивые кристаллы. Иногда необходимо проводить исследование при высоких или низких температурах. Это сильно затрудняет проведение эксперимента. Полное исследование очень трудоёмко, длительно и сопряжено с большим объёмом вычислительной работы.

Для установления атомной структуры средней сложности (~50- 100 атомов в элементарной ячейке) необходимо измерять интенсивности нескольких сотен и даже тысяч дифракционных отражений. Эту весьма трудоёмкую и кропотливую работу выполняют автоматические микроденситомеры и дифрактометры, управляемые ЭВМ, иногда в течение нескольких недель и даже месяцев (например, при анализе структур белков, когда число отражений возрастает до сотен тысяч). В связи с этим в последние годы для решения задач рентгеноструктурного анализа получили широкое применение быстродействующие ЭВМ. Однако даже с применением ЭВМ определение структуры остаётся сложной и трудоёмкой работой. Применение в дифрактометре нескольких счётчиков, которые могут параллельно регистрировать отражения, время эксперимента удаётся сократить. Дифрактометрические измерения превосходят фоторегистрацию по чувствительности и точности.

Позволяя объективно определить структуру молекул и общий характер взаимодействия молекул в кристалле, исследование методом рентгеноструктурного анализа не всегда даёт возможность с нужной степенью достоверности судить о различиях в характере химических связей внутри молекулы, так как точность определения длин связей и валентных углов часто оказывается недостаточной для этой цели. Серьёзным ограничением метода является также трудность определения положений лёгких атомов и особенно атомов водорода.